間充質干細胞（mesenchymalstem cells），或者，間充質基質細胞（mesenchymal stromal cells），縮寫都是MSCs。本文試圖以時間軸為主線，講述MSCs的研究歷程上比較重要的事件。

       1966年，Friedenstein教授發(fā)現骨髓細胞移植能在體內分化為成骨細胞[1]，隨后在1968年提出存在成骨細胞和造血細胞的祖細胞[2]，1971年通過動物實驗進一步證實成骨祖細胞的存在[3]，1974年成功通過貼壁分離培養(yǎng)的方法, 發(fā)現從骨髓中貼壁分離一種成纖維細胞樣的細胞，具有分化為成骨細胞的細胞集落(CFU-F)，而且支持造血克隆的形成[4, 5]；當時還沒意識到這種骨髓基質細胞具有多項分化潛能；1987年明確提出這種骨髓基質細胞（成纖維細胞克隆形成細胞，fibroblastcolony-forming cells，FCF-C）為成骨干細胞（osteogenic stem cells），經過20-30次的倍增增殖后，植入大鼠腹膜內依然可以形成骨組織[6]；1988年，將這種成骨祖細胞命名為骨髓基質干細胞（marrow stromal stemcells）[7, 8]。

        成骨干細胞除了osteogenicstem cells這種寫法，還有一詞osteoprogenitors，其最早見于1984年關于細胞核大小的描述[9]。1990年確定osteoprogenitors屬于基質細胞（mesenchymal cells），具有分化成骨細胞和軟骨細胞的能力[10]。

       1987年，Charbord博士發(fā)現在馬血清的培養(yǎng)下，骨髓基質細胞在攝取血清蛋白方面有別于骨髓成纖維細胞，從而明確了MSCs并不是成纖維細胞，雖然在體外培養(yǎng)時的細胞形態(tài)和成纖維細胞很相似[11]。

       1991年，北愛爾蘭Queen's University Belfast的一個實驗室從臍帶華通氏膠（Wharton'sjelly）中通過組織塊培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)出MSCs，當時稱呼為“成纖維細胞樣細胞”，至少能傳代至第6代，能分泌膠原蛋白和細胞角蛋白（CK）等[12]。但是當時對MSCs的研究和認識都不深刻，尚未認識到MSCs的強大免疫抑制和分泌細胞因子的功能。2000年，智利大學的一個實驗室從臍血中分離出單個核細胞，然后貼壁純化培養(yǎng)獲得MSCs[13]。隨后，不同的實驗室在不同的組織中均分離和培養(yǎng)出MSCs，比如脂肪、羊膜、牙齦、胸腺、胎盤、滑膜、胎血、胎肝、胎肺等。

       1991年，Charbord博士開始用一些細胞表面標記物來識別MSCs：CD45、HLA-DR 、CD33 、CD11c、vW因子、a-SMA、纖維連接蛋白（fibronectin）、CD68、CD51[14]。1993年Charbord博士檢測了MSCs細胞表型：CD10、CD14、CD34、CD45、CD44、LFA-1α、LFA-1β、LFA-3、CD29、VLA-1、VLA-2、VLA-4、VLA5、VLA-6、Stro-1、VCAM-1[15]。

       1992年，來自于Friedenstein教授團隊的Owen博士證明MSCs同時具有向脂肪細胞和成骨細胞分化的能力；培養(yǎng)基中存在地塞米松的情況下，MSCs向脂肪分化占主導地位，抑制了向成骨細胞分化；在地塞米松和1，25-二羥維生素D3共同培養(yǎng)時，脂肪細胞的分化受到抑制，而成骨細胞的分化則增強[16]。1999年《science》首次證明MSCs在體外同時具有向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞分化的能力[17]。真是這篇文章，點燃了大家對MSCs的研究熱情，集中在研究MSCs的各種分化功能，期待著MSCs在再生醫(yī)學中發(fā)揮巨大的作用。

       雖然1974年Friedenstein教授認識到MSCs參與了造血微環(huán)境的一個組成細胞支持造血[5]，但到1992年才明確提出MSCs作為滋養(yǎng)層細胞支持造血干細胞向粒細胞、巨噬細胞和巨核細胞分化[18, 19]，而且這種支持作用在于MSCs分泌這些生長因子（CSF-1、GM-CSF、G-CSF、IL-6、c-kitligand和IL-3）[19]。

       1992年發(fā)現年齡大的大鼠骨髓MSCs的數量較年輕者少，即成纖維細胞集落形成單位(FCF-U)少，貼壁細胞少[20]。1999年發(fā)現在人體上存在同樣的現象，即骨髓MSCs的數量隨著年齡增大而減少[21]。

       不同于Friedenstein教授和Charbord博士是研究人的骨髓MSCs，Caplan教授剛開始是研究雞胚胎的骨髓MSCs，根據雞胚胎骨髓MSCs的特性，提出MSCs是來源于中胚層（Mesodermal），結合前人的研究成果，于是在1991年將MSCs命名為間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)[22]。誰都沒想到，MSCs被命名為間充質干細胞后，這個名稱備受歡迎，大量的研究文章都采用這個名字。下面的一張MSCs體外分化示意圖，至少出現在Caplan教授的四篇文章中（Tissue Eng Part A, 2010/Annu Rev Pathol, 2011/Cell Stem Cell, 2011/StemCells Transl Med, 2017）。 

       1994年，Caplan教授連發(fā)3篇文章提出自體MSCs在骨和軟骨的組織再生醫(yī)學方面有非常好的治療前景[23-25]。1995年報道MSCs的第一篇臨床研究成果，從惡性血液病患者骨髓抽取并分離培養(yǎng)出這些貼壁的基質細胞，然后回輸到患者體內，觀察臨床效果并證明這些基質細胞的安全性[26]。這是一個足以載入史冊的研究，是間充質干細胞研究史上的第一個里程碑式的事件，使間充質干細胞的研究從實驗室跨入到實際的臨床應用。在1990年代，Caplan教授和他的同事創(chuàng)辦的Osiris治療公司，生產制備MSCs注射液（Prochymal）于2012年在加拿大有條件獲批，用于兒童移植物抗宿主?。℅VHD）的治療。 

       1997年，Darwin J. Prockop博士在《science》撰文，提出MSCs為骨髓基質細胞（Marrow Stromal Cells）[27]；隨后在1998年提出MSCs可以作為基因治療的載體[28]。2002年提出根據細胞的大小來判斷MSCs的質量，即培養(yǎng)過程中，胞體小的MSCs具有最強的成脂潛能與產生單細胞集落的能力[29]。

       2000年，《nature medicine》采用人骨髓MSCs子宮內注射到孕65天和85天的羊胎（相當于145天的人胎）的腹膜腔，移植后長達13個月的時間內在多個組織中存活，而且移植后的人MSCs在體內分化為軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞和心肌細胞、骨髓基質細胞和胸腺基質細胞；這研究結果直接證明了MSCs的多項分化潛能[30]。

       2000年，一個關于細胞治療的學術會議上，Charbord博士提出CD34/45陰性、CD10/13陽性和Thy-1(CD90)陽性是MSCs表型的一個關鍵成分；Simmons博士建議在骨髓收獲后立即研究間充質細胞，以Stro-1陽性，糖激素A陰性作為鑒定這些細胞的標準，并建議將STRO-1、Thy-1、VCAM-1陽性細胞和CD45陰性細胞作為候選群體；研討會建議，鑒定間充質細胞的最小決定因素可能是Thy-1、Stro-1、平滑肌肌動蛋白、I型膠原和vimentin，而CD45陰性，盡管在這一點上沒有明確的共識[31]。Charbord博士和Simmons博士是最早關注MSCs的細胞表面標記物的科學家。

       2002年，Charbord博士和Caplan教授聯合研究證明Stro-1陽性MSCs為多潛能干細胞[32]，但是2004年Charbord博士參與的研究團隊發(fā)現Stro-1陽性MSCs和Stro-1陰性的MSCs均有歸巢的功能，而Stro-1陽性MSCs卻不能支持造血[33]。

       2002年，2個團隊分別發(fā)現了間充質干細胞有強大的免疫抑制能力[34, 35]。2003年Le Blanc博士發(fā)現MSCs本身具有低免疫原性，即使異體或跨種屬使用，均不會引起免疫排斥反應[36]。LeBlanc博士在2004年《Lancet》發(fā)表MSCs治療移植物抗宿主病（GVHD）的臨床研究的文章[37]。這是第一篇利用MSCs的免疫抑制能力來發(fā)揮治療作用的臨床研究文章。廣泛性免疫抑制功能可以說是MSCs專屬的獨特性功能，對多種免疫細胞均有抑制活化的功能。具有類似功能的Treg細胞，抑制范圍僅限于T淋巴細胞。MSCs的免疫抑制功能的發(fā)現，也極大地推動了MSCs的臨床研究，用于治療免疫反應性疾病。

       2004年，Paolo Bianco教授建議MSCs命名為骨骼干細胞（skeletal stem cells），而且通過轉基因小鼠證明持續(xù)升高的甲狀旁腺激素通過甲狀旁腺激素相關肽受體，促進MSCs向骨細胞分化，成骨祖細胞增多，但是同時耗竭骨髓中的MSCs[38]。PaoloBianco教授隨后根據發(fā)育學的一些相關證據，對骨骼干細胞的本質進行多方面的闡述，指出MSCs的本質就是骨骼干細胞，強調骨骼干細胞本身的正確概念對于正確的臨床應用有密切相關性[39-41]。

       2005年，國際細胞治療協(xié)會（民間組織）認為MSCs在體內沒有分化能力，不具有“干細胞”的特性，建議MSCs命名為多潛能間充質基質細胞（multipotent mesenchymal stromal cells）[42]，并在2006年提出多潛能間充質基質細胞的最低定義標準：①貼壁培養(yǎng)，②特異性表面抗原表達（細胞表型），③向成脂成骨和軟骨細胞分化的能力[43]。本小編對這個命名表示頗為不理解，既然認定MSCs為多潛能，那就意味著MSCs有多項分化能力；有了多項分化能力，為何不可以稱為“干細胞”？而且那么多的動物實驗都證明MSCs可以在體內分化為成骨細胞和軟骨細胞，難道這都還不能稱為“干細胞”？大咖也會為了推出自己的觀點而選擇性忽視對自己不利的證據。由于尚未找到MSCs特異性細胞表面標記物，研究者多參考國際細胞治療協(xié)會提出的定義標準。

       2005年首次發(fā)現病人（再障）的骨髓MSCs的免疫抑制功能出現病理性降低[44]，但不清楚疾病導致MSCs的免疫抑制功能降低，還是先出現MSCs的免疫抑制功能降低再出現疾病？隨后發(fā)現多發(fā)性骨髓瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎和ITP等患者的骨髓間充質干細胞的免疫抑制能力也出現損傷，以及增殖速度減慢、分泌細胞因子減少等改變[45]。

       1990年，Diaz-Flores博士發(fā)現骨骼和骨骼周圍組織血管周圍有一種細胞具有祖細胞的特性，能促進血管新生和組織修復的功能，鑒定為血管周細胞（pericytes）[46]；隨后2年內證明這種周細胞具有向成骨細胞和軟骨細胞分化的能力[47, 48]。1993年Bianco博士利用激光共聚焦技術觀察到骨髓基質細胞定位在骨髓血管周圍[49]。2006年小鼠實驗證明MSCs分布在全身血管周圍，因此幾乎全身所有的器官和組織基質中均存在MSCs[50]。2008年Bruno Peault博士的研究清楚地證明，從各種組織中分離出來的周細胞產生的MSCs，都具有相同的細胞表面抗原及其體外多能性[51]。同年Caplan教授提出大多數間充質干細胞是從血管周圍或壁細胞(周細胞)分化而來的[52]。重要的是，MSCs可以從每個血管化的組織中分離出來[53]，甚至可以從月經中分離出來(即破碎的血管釋放血管周圍的細胞，并分化為MSCs)[54, 55]。脂肪組織的周細胞和MSCs具有相似的基因譜[56]。MSCs來源的血管周圍位置及其免疫調節(jié)和營養(yǎng)功能(包括制造和分泌抗生素蛋白[57])對MSCs的“基質”名稱和來源提出了挑戰(zhàn)。2017年中美科學家使用可誘導的TBX18-CreERT2系進行的系譜追蹤實驗表明，周細胞和血管平滑肌細胞在衰老和不同的病理環(huán)境中保持著它們的特性，和MSCs有著不同的行為特征，比如在衰老和疾病狀態(tài)下MSCs具有成脂分化[58]。

       那么，MSCs到底是不是周細胞？如果是的話，那就能解釋為何在身體的多個組織器官均能發(fā)現MSCs的存在，因為有血管的存在，那就有周細胞的存在。如果不是，那么MSCs和周細胞在發(fā)育胚胎學上有什么關系？

       2009年，有學者認為人臍帶的血管周圍細胞（umbilical cord perivascular cells）屬于臍帶MSCs的一個亞群，具有MSCs相似的功能，提出MSCs群體的異質性，即不同的亞群之間的分化功能略有區(qū)別，MSCs隨著培養(yǎng)時間延長，多項分化功能逐漸喪失，而均一化為“成纖維細胞”[59]（見下圖）。2012年和2017年的兩篇綜述文章對這個觀點表示認可[60, 61]，但是都沒有實錘證據。如果MSCs經過長期培養(yǎng)后變成成纖維細胞，即喪失向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化的能力。實際上，長期培養(yǎng)后，臍帶MSCs（P30）依然具有向脂肪細胞和成骨細胞的能力[62]。如果根據MSCs的細胞大小來斷定MSCs的異質性，那也是不科學的，因為MSCs在培養(yǎng)過程中，處于不同的細胞分離周期，MSCs的胞體大小當然不一樣。關于MSCs異質性可能最直接的證據就是：幾乎所有的MSCs均能分化為成骨細胞，但不是所有的MSCs都能分化為脂肪細胞。那么，如何理解MSCs異質性？ 

       在上個世紀的70年代，MSCs的體內分化能力已經得到確認。而MSCs體內自我更新的能力直到2007年和2010年的兩篇關于骨髓niche的研究才得到體內證據的支持[63, 64]，當在體內移植時，這些細胞產生一個具有合適的組織學和結構的微環(huán)境（niche），在這個niche中，接受造血干細胞移植的動物的造血功能得以建立。即MSCs是能夠在體內產生一個完整的異位骨或骨髓器官(Ossicle)的單個細胞，具有與原先移植細胞相似的表型和特性的血管周圍基質細胞[63]。骨骼組織的祖細胞（MSCs）既是造血微環(huán)境的組織者和造血功能維護者[63-65]。PaoloBianco教授認為這種在體內的潛力是系統(tǒng)限制的和細胞自主的，并且不需要與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)相結合，MSCs在體內不具有產生非骨骼組織細胞的潛能[66]。所以，Paolo Bianco教授建議MSCs命名為骨骼干細胞。但是，把MSCs注射到羊的胚胎中，MSCs卻可以分化為軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞和心肌細胞、骨髓基質細胞和胸腺基質細胞[30]。因此，即使是大咖，也會為了支持自己的觀點而選擇性地忽略掉一些對自己不利的證據。

       2008年，《Nat Rev Immunol》提出MSCs的作用方式為“Touch and Go”（接觸后離開），即MSCs通過其快速遷移到受損的器官，并釋放應激誘導的治療分子后被機體清除[67]。2010年另一篇文章提出類似的觀點，即“Hit and Run”（打擊后離開）[68]。

       2010年，Caplan教授建議將MSCs的名稱改為藥物信號細胞（Medicinal Signaling Cells），名字的縮寫也是MSCs[69]，以更準確地反映這些細胞位于損傷或疾病部位并分泌生物活性因子[70]。這些生物活性因子具有免疫調節(jié)和營養(yǎng)的功能[71]，這意味著這些細胞制造藥用的治療物質[72]。實際上，正是患者自身的部位特異性和組織特異性的干細胞構成了新的組織，而這些新的組織是由外來MSCs分泌的生物活性因子刺激組織自身干細胞所產生的[73, 74]。2017年Caplan教授認為MSCs屬于周細胞，并提出新的假設：MSCs作為黑色素瘤向骨轉移的守護者[75]。2018年，有專家認為將MSCs重新歸類為“基質細胞”或“信號細胞”無助于解決MSCs的最終本質和生物學功能特性[76]。無論稱呼如何，指導其臨床開發(fā)和使用的科學原則必須與其他新療法的原則相同：精確性、有效性、定性、客觀性，而不是具有誤導傾向的術語和概念模型[76]。毫無疑問，2019年，Caplan教授針對這篇文章給予回應，而且繼續(xù)呼吁MSCs并非干細胞，而是藥品信號細胞[77]。命名MSCs為干細胞的，是你；呼吁MSCs不是干細胞的，也是你。

       2011年7月，韓國食品藥品管理局準許由FCB-Pharmicell公司開發(fā)的MSCs藥物Hearticellgram-AMI在韓國上市，適應癥為急性心肌梗塞。Hearticellgram-AMI成為全球首個利用自身骨髓MSCs制成的治療急性心肌梗死的干細胞藥物，給藥途徑為局部冠狀動脈注射。2012年1月中旬連續(xù)批準Medi-post公司的軟骨再生治療藥物Cartistem和Anterogen公司的肛瘺治療藥物Cuepistem的生產許可。Medi-post公司的Cartistem是從臍帶血中分離培養(yǎng)的MSCs專門治療退行性關節(jié)炎和膝關節(jié)軟骨損傷的干細胞藥物。Anterogen公司的Cuepistem是從患者本人的脂肪組織中分離培養(yǎng)的MSCs治療復雜性Crohn’s病并發(fā)肛瘺。

       2012年，Osiris公司宣布全球首個MSCs的III期臨床試驗失敗，即MSCs治療兒童GVHD的III期臨床試驗的結果和安慰劑組沒有差異，給與MSCs行業(yè)一個幾乎致命的打擊。當時的III期臨床試驗的數據并沒有整理發(fā)表文章，但是2013年有篇文章專門點評這件事，分析失敗原因和今后的發(fā)展方向[78]。當然，Prochymal 失敗的原因有很多，本小編也曾詳細地分析過[79]。Prochymal（MSCs）的失敗，促進了對MSCs本身進行深入的研究，比如MSCs的分離技術、培養(yǎng)技術、MSCs細胞質量、群體異質性、供體的健康狀態(tài)等等方面。同時，2012年美加兩國研究者發(fā)現液氮冷凍運輸至病床邊復蘇的做法對MSCs的免疫功能有損害[80]。雖然美國FDA沒有批準Prochymal上市，但是Prochymal卻在加拿大獲得有條件上市。隨后，英國（2012年）和歐盟（2014年）的治療指南推薦MSCs作為治療2-4級急性GVHD的三線治療藥物[81, 82]。

       2016年7月份《Lancet》報道全球第二個MSCs的III期臨床試驗的結果，即Cx601（脂肪MSCs）治療復雜肛周瘺克隆恩病的多中心隨機對照III期試驗（RCT），這項研究包括212名患者，107名患者接受了ASCs治療，105名患者接受了安慰劑治療；接受ASCs治療的患者中有50%實現了聯合緩解，而安慰劑組中的34%的患者在24周達到了聯合緩解，MSCs治療的效果明顯優(yōu)于安慰劑組[83]。Cx601治療復雜肛周瘺克隆恩病的長期療效觀察結果在2018年發(fā)表，在52周時，接受Cx601治療的患者中達到聯合緩解的比例(56.3%)顯著高于對照組(38.6%)(P=0.010)，臨床緩解率(59.2%vs 41.6%，P=0.013)；Cx601組不良事件發(fā)生率為76.7%，對照組為72.5%[84]。這次III期臨床試驗的結果明顯優(yōu)于對照組，歐盟在2018年3月批準Cx601（Alofisel）上市用于克羅恩病患者復雜性肛周瘺的治療。 

2018年，我國CFDA重新放開細胞產品的注冊申請，邁出了歷史性的一步。我國MSCs新藥注冊見下表：

       在生理上，MSCs位于血竇的外表面，血竇是骨髓中一種典型的血管類型 (紅色箭頭所指就是MSCs)。 

       血竇是骨髓中三維血管周圍基質間隔的一部分，在骨骼的器官形成過程中起源于原始軟骨膜上的成骨細胞，并與生長的血管一起侵入骨底，形成造血干細胞的微環(huán)境（niche）(圖)。

       造血干細胞有著比MSCs更悠久的研究歷史，而且在臨床應用上，造血干細胞移植后有一部分（約10%）能遷移到骨髓中定居下來，重建了整個造血系統(tǒng)，伴隨著整個生命周期。正是由于造血干細胞給人們的印象過于深刻，導致人們也期盼著這個稱為“干細胞”的MSCs也像造血干細胞一樣，一次成功的輸入移植能永久成活。但是，如果深入思考，就會發(fā)現MSCs和造血干細胞的功能特性完全不一樣，治療方式也不一樣。比如，①造血干細胞移植之前，需要殺死原本身體中存在于骨髓中病變的造血干細胞（俗稱清髓），給新來的造血干細胞騰出空間（niche）發(fā)揮功能，而現在如何能做到殺死原本身體中存在的MSCs以騰出空間？②造血干細胞只有在自己的巢（niche）中才能長期存活，只有能存活下來才能進行分化，而MSCs的巢在哪里？因此，不能根據造血干細胞的表現來生搬硬套在MSCs身上。

       由于MSCs不表達MHC-II類抗原，具有低免疫原性，而且還能抑制免疫反應，因此有專家認為MSCs屬于免疫豁免的細胞。但是，大量的動物實驗和有限的臨床研究均顯示輸入的異體MSCs均不能在體內長期存在，而且這些數據都是來源于分娩以后的動物和人類。既然MSCs不能在體內長期存在，那么MSCs就無法分化為子代細胞而發(fā)揮細胞替代作用，也就是說分化作用不是MSCs的治療機制。這也是為什么Caplan教授強調MSCs并不是干細胞的原因。即使分化作用不是MSCs的治療機制，但也不應該否認MSCs的干性（體內自我更新和分化），因為上文已經論述過MSCs在體內具備自我更新和分化的功能。